密理博Millipore Amicon Ultra 系列超濾離心管

密理博Millipore Amicon Ultra 系列超濾離心管，此類產(chǎn)品屬于一次性耗材，不可重復(fù)使用。

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超濾相關(guān)常見(jiàn)術(shù)語(yǔ)

超濾

超濾（UF）常用于分離溶液中極其微小的顆粒和不溶分子。雖然分離效果受到包括化學(xué)性質(zhì)、電荷等多種因素影響，這種方法主要還是以分子大小為最基本的考慮。超濾膜截留1-1000kDa（MW）的分子，鹽和水等小分子會(huì)透過(guò)，因此在大分子樣品處理中得到了廣泛應(yīng)用。膠狀或微粒狀物質(zhì)也能夠被截留。UF膜既可以用于透過(guò)樣品也用于保留樣品的純化。樣品顯著小于膜孔徑，則經(jīng)過(guò)膜處理可以達(dá)到除熱源、澄清和與大分子污染物的分離的效果。如果目的分子遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于膜孔徑，膜處理則可以將小分子污染物去除而目的分子被濃縮。超濾方法相比沉淀法對(duì)于樣品更溫和，沒(méi)有發(fā)生容易導(dǎo)致生物大分子失活的相變，而且在濃縮的同時(shí)可以完成對(duì)溶質(zhì)的除鹽。超濾的應(yīng)用不限于蛋白樣品的操作，也常用于核酸樣品制備，包括分子克隆和質(zhì)粒純化。DNA和RNA樣品起始濃度低至5ng/mL也可以被高效地在數(shù)分鐘內(nèi)被濃縮，回收率達(dá)到99%以上。

離心方式的超濾方法進(jìn)行溶液置換也被稱為“滲濾”，操作時(shí)樣品首先被濃縮，繼而加入新的溶液，再次濃縮時(shí)，原溶液已經(jīng)被換成選定的溶液。

化學(xué)相容性與溶出

樣品的化學(xué)背景有時(shí)很多樣而復(fù)雜，過(guò)濾的過(guò)程中很重要的一點(diǎn)是操 作過(guò)程不應(yīng)給樣品帶來(lái)新的污染。所以濾膜和裝置與樣品接觸的其它 部分都不能與樣品中的化學(xué)成分發(fā)生反應(yīng)而產(chǎn)生溶出污染。

回收率及其重要性

超濾的最終目的常常是最大程度地回收目標(biāo)溶質(zhì)，但膜的很多特性會(huì) 對(duì)這一目的產(chǎn)生影響。影響回收的因素包括：
? 標(biāo)稱分子量限制（NMWL）/ 核酸截留分子量（NCO）

? 截留

? 濃差極化

? 通量

標(biāo)稱分子量限制

微濾中膜的孔徑大小通常以微米計(jì)，表示大于這一規(guī)格的顆粒將被膜 截留。超濾膜根據(jù) NMWL 分級(jí)，有時(shí)也用截留分子量（MWCO）。 NMWL 表示大多數(shù)大于這個(gè)值的分子將在超濾時(shí)截留。一個(gè)確定 NMWL 的超濾膜應(yīng)該截留至少 90% 以上的這個(gè)大小的球形分子。但為 了保險(xiǎn)起見(jiàn)，實(shí)踐中選擇的膜孔徑要小于目的分子。緩沖液置換時(shí)膜 截留分子量應(yīng)該充分大于流過(guò)的溶質(zhì)。當(dāng)膜材料相同時(shí)，孔徑減小會(huì) 增加排阻而減小濾過(guò)率。截留及產(chǎn)物回收的影響因素包括分子的形狀、 帶電性質(zhì)、樣品濃度及組成成分、操作條件、使用的設(shè)備構(gòu)造等。因 此常常發(fā)生同樣 NMWL 的膜對(duì)一定范圍內(nèi)的不同分子截留效果有一定 差異的情況。使用超濾方法進(jìn)行樣品濃縮或除鹽時(shí)，需要謹(jǐn)慎地選擇 合適的 NMWL 膜和設(shè)備。雖然影響因素較多，我們通常建議截留分子 量約為目的分子分子量一半的膜，這樣可以最大化樣品的回收，同時(shí) 節(jié)省過(guò)濾時(shí)間。

核苷酸截留分子量（NCO）

超濾膜的 NMWL 是用球形蛋白標(biāo)定的，適合各種蛋白研究，但在核酸 和多糖純化時(shí)則要考慮更多因素。這些分子的棒狀的三維結(jié)構(gòu)容易漏 過(guò)，相對(duì)于球形蛋白需要更致密的膜（截留分子量更?。Ｋ赃x擇 濾膜是更多考慮的是核苷酸長(zhǎng)度而非分子量。

截留

截留有時(shí)也稱為排阻。水合程度、離子和空間位置效應(yīng)會(huì)導(dǎo)致分子量相近 的分子表現(xiàn)非常不同的截留狀態(tài)。許多生物大分子在不同的 pH 或離子強(qiáng) 度改變的情況下傾向于聚集或改變構(gòu)象，因此其有效大小可能比 “天然”分子大很多，從而導(dǎo)致排阻增加。比如，有些蛋白質(zhì)在某些緩沖液條件下會(huì)發(fā)生多聚化，而另一些則發(fā)生解聚（如血紅素蛋白）成亞基。這使選擇合適截留分子量的膜變得復(fù)雜。以我們的經(jīng)驗(yàn)，我們通常推薦選擇為目的分子大小一半的膜作為嘗試的首選，再根據(jù)實(shí)際情況加以調(diào)整。

濃差極化

濃差極化實(shí)質(zhì)是溶質(zhì)累積在膜表面造成的堵塞，產(chǎn)生除了膜本身截留分子量以外的過(guò)濾限制。當(dāng)溶質(zhì)濃度較高時(shí)，會(huì)形成相當(dāng)于第二層濾膜作 用的膠體層，干擾分子通過(guò)濾膜，同時(shí)降低流速。pH 值、緩沖液的成分 也會(huì)影響目的分子的狀態(tài)而使?jié)獠顦O化現(xiàn)象加劇或減輕。

通量（超濾效率）及其影響因素

超濾過(guò)程中需要在速率和回收率之間平衡以期獲得最好的效果。濾膜的通量的定義是流量除以面積，使用高 NMWL 濾膜可以增加通量，但同時(shí)會(huì)降低回收率。選擇膜和裝置時(shí)需要同時(shí)考慮截留分子量和通量。而參與影響通量的因素很多，包括：

• 壓力：較為稀釋的蛋白溶液或膠體懸液進(jìn)行超濾時(shí)，流量隨著跨膜壓力（TMP）的增大而增加。正壓條件下操作，如 Stirred Cell 攪拌式超濾杯， 這種因素影響較為明顯。如果極化影響顯著，通量會(huì)達(dá)到一個(gè)平臺(tái)，甚 至可能隨著壓力的增加而降低。
• 濃度：當(dāng)需要截留的樣品濃度很低時(shí)，通量通常不受濃度影響。操作過(guò) 程中，隨著溶質(zhì)濃度的升高，增加的粘滯性和極化將導(dǎo)致通量降低。
• 溫度：通常增加操作時(shí)的溫度可以提高超濾效率。每增加 1℃蛋白擴(kuò)散率增加 3-3.5%，同時(shí)溶液粘度降低。 實(shí)踐中一般是以樣品和設(shè)備能耐受的最高溫度來(lái)操作。
• pH：改換溶液和 / 或 pH 常常改變分子結(jié)構(gòu)，蛋白尤其如此。在蛋白的 pI 值蛋白會(huì)沉淀，產(chǎn)生堵塞和得率損失。
• 污垢：溶液中除了目的分子造成的濃差極化，還有其它小顆粒和分子會(huì) 在膜上富集和沉淀，逐漸堆積在膜孔上或膜孔結(jié)構(gòu)中，形成結(jié)晶和沉淀。

操作模式

常規(guī)與切向流 : 常規(guī)溶液過(guò)濾（NFF）中液體在壓力或真空驅(qū)動(dòng)下直接流 過(guò)膜。大的顆粒物被膜截留并堆積在膜上，小分子則通過(guò)膜流出。NFF 常用于無(wú)菌過(guò)濾、澄清預(yù)過(guò)濾及病毒 / 蛋白樣品制備等。切向流過(guò)濾（TFF） 液體流過(guò)時(shí)與膜表面呈一定角度，被膜阻擋的大顆粒物不會(huì)累積在膜表 面，而且還會(huì)被切向流從膜表面掃除，因此 TFF 成為按分子大小不同分離 的主流方法。TFF 在大體積樣品處理中是主要的操作方法，而現(xiàn)在，TFF 技術(shù)被用于 Amicon? Ultra 離心式超濾管的設(shè)計(jì)中，使小體積樣品的濃縮和分離操作也變得更加方便。

膜的吸附損失

對(duì)于濃度很低及珍貴的樣品，除了考慮截留效率和操作方便外，額外要關(guān)注的是采用的超濾膜及設(shè)備對(duì)目標(biāo)蛋白的潛在非特異性吸附損失。不同膜材質(zhì)對(duì)生物分子吸附程度不同，默克密理博的生纖維素膜在各類膜中對(duì)生物分子吸附最小，是 Amicon? UltraUltracel超濾管
等超濾產(chǎn)品成為首選的核心技術(shù)關(guān)鍵之一。濾膜和裝置表面對(duì)溶質(zhì)的吸附對(duì)樣品收率會(huì)產(chǎn)生直接影響，所以如果希望盡可能提高得率，就應(yīng)該考慮采用較小的設(shè)備和膜面積。小量的、較為稀釋的樣品應(yīng)該選用膜面積小的裝置，同時(shí)保證一定的流速。默克密理博設(shè)計(jì)了一系列離心式或攪拌式裝置，配合不同的膜面積、不同的截留分子量的切向流系統(tǒng)，支持您獲得理想的處理效果。

用超濾對(duì)分子進(jìn)行分級(jí)

通過(guò)選定截留分子量的超濾操作能精確地將混在大分子中的小分子去除的想法常常不切實(shí)際。事實(shí)上，膜的規(guī)格描述是基于截留而非通過(guò)的性質(zhì)。一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中，采用100k NMWL 濾膜，大于100kDa的分子截留率>90%，但這時(shí)比膜孔徑小的分子并不是完全自由地通過(guò)濾膜，75kDa溶液中的各的分子截留率為83%，30kDa 的分子也有32%被截留?；旌系娜芤褐械母鞣N成分通過(guò)膜并不像單一成分的溶液那么簡(jiǎn)單和容易。實(shí)踐中，如果要分離兩種大分子，它們之間的分子量差異應(yīng)該達(dá)到10 倍以上，或至少膜的NMWL規(guī)格在兩種蛋白之間，則可達(dá)到比較理想的分離。如果蛋白溶液較為稀釋，低壓下操作也有助于達(dá)到更好的效果。

Amicon^? Ultra超濾管選擇指南

超濾的應(yīng)用和?超濾膜的選擇